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【討論】流感病毒雞胚傳代經驗

在實驗室剛開始用MDCK細胞傳代流感病毒,一直都沒效價.後面就只能用雞胚試試.

1. 恆溫孵化器雞胚孵育
1.1 購買受精雞蛋,我們就在旁邊菜市場買的散養的土雞蛋,哈哈,購買5天(最多不能超過7天)以內的白皮(卵殼潔白,易於照射觀察雞胚)新鮮蛋。
1.2 70%酒精擦拭蛋殼消毒 (如蛋殼較髒,可先用溼紗布擦拭乾淨)備用。
1.3 把孵化器的蛋託網盤取出,分別清洗機座和蛋託,乾燥後70%酒精噴灑擦拭消毒,在機座水槽內加滿滅菌純水,再把蛋託放入機座內。
1.4把雞蛋輕輕放入蛋託,氣室朝上(大頭),標記好日期。設置溫度爲37.8℃。



1.5每日觀察水槽內水位,及時加水。
1.6孵育至第4天,用照蛋燈檢查雞胚受精與否及發育情況(受精雞卵可見清晰的血管小團和發育的雞胚跡象,似蜘蛛狀;未受精雞卵僅能見模糊的卵黃黑影,無雞胚跡象。


1.7孵育9~11天。

1.用無菌生理鹽水將1:128的病毒液按1:400左右稀釋,這個稀釋倍數根據具體情況吧,有時稀釋倍數相差很大也能種出來.
2.注射點用酒精燈烤過的小尖頭鑷子在接種部位開一個3-5mm大小的小孔,用1ml注射器注入200?l稀釋的病毒液至尿囊腔中。用封口膜將小孔密封,氣室朝上置於卵架上,放入37.8℃孵化器中繼續孵育(有時放在細胞培養箱也行)。



孵育48h後,將雞胚置於4℃冰箱至少6h,避免收穫時流出的血液同尿液中的病毒發生凝集,造成病毒滴度下降。
經冰凍的雞胚用70%酒精消毒氣室部位卵殼,鑷子除去氣室上方的蛋殼,注意勿使卵殼碎片落在未損傷的殼膜上,撕破絨毛尿囊膜,用一次性無菌吸管輕插於尿囊腔中,緩慢吸取尿囊液於無菌離心管內。注意避開血管,不要刺破卵黃囊。每枚雞胚可收穫6-10ml清亮微黃尿囊液,2000rpm 離心10min去除尿囊液中雜質及紅細胞。



收穫病毒用血凝試驗初步驗證,一般滴度有1:128,做一般試驗還是夠用了吧.進一步驗證我們用的是自己設計的病毒特異性引物,用病毒感染細胞,提取細胞RNA,逆轉錄成cDNA,再跑個PCR就OK了。