纸质:通过免疫色谱抗原测定的肺炎患儿支原体肺炎的快速诊断

时间:2015-10-22


SCI REP。2015; 5:15539。
2015年10月21日在线发布。DOI:10.1038 / srep15539.
PMCID:PMC4614389.

快速诊断支原体肺炎通过免疫色谱抗原测定患儿患有肺炎的儿童

Abstract

支原体肺炎是一种特别重要的病原体,导致群落获得儿童肺炎。在这项研究中,开发了快速测试以诊断M.肺炎通过使用靶向P1基因的区域的胶体金基免疫色谱测定法。通过实时PCR并行分析302样品。胶体金测定分析。有趣的是,允许胶体黄金测定M.肺炎识别,检测限为1×103拷贝/ ml。发现76个样品在实时PCR和胶体金测定中是阳性的;在快速胶体金测定中,实时PCR阳性的两个样品在阴性中。胶体金测定的特异性和敏感性分别为100%和97.4%。这些发现表明新开发的免疫色谱抗原测定是一种快速,灵敏的和识别方法的方法M.肺炎,潜在的临床应用在早期诊断中支原体肺炎感染。

支原体肺炎 (M.肺炎)是在儿童中引起社区肺炎(盖子)的主要病原体之一1,2,3。它可以触发一系列病理生理反应,这可能会导致呼吸道症状(阵发性刺激咳嗽,喉咙痛,粘性痰和/或脓性痰)和各种并发症,如支气管哮喘,急性呼吸窘迫综合征,Guillain-Barre综合征,多关节炎和冠状动脉疾病4,5,6。目前,有几种方法可用于诊断M.肺炎感染,包括培养,血清学试验和实时PCR技术7,8,9。然而,M.肺炎培养和血清学检测不敏感,耗时和交叉反应;因此,它们不适合快速准确地检测M.肺炎临床实践中的感染9。最近,许多作者报告了实时PCR作为快速,敏感和特异性的方法,但仍需要至少2-4小时进行DNA提取和扩增10,11,12,13。此外,实时PCR可能不会歧视活力M.肺炎从死者9。在这项研究中,我们通过使用一对单克隆抗体来制定一种基于免疫色谱的快速测试试剂盒,其靶向P1表面蛋白的保守区域M.肺炎。然后,进行大型样品大小研究以评估新开发系统的临床诊断值,与商业实时PCR测定相比。

Results

M.肺炎胶体金测定中的检测

As shown in Fig. 1, M.肺炎在样品中的存在导致测试和控制线都为正。一个没有M.肺炎仅显示一个正控制线。确认胶体金测定的检测能力,标准类型I和II的P1基因M.肺炎测试菌株。结果表明,FH(II型M.肺炎)和m129(类型iM.肺炎)胶体金测定中的菌株是阳性的(Fig. 2)。

图1
胶体金板设置(A)代表负面样本,(B)阳性样本)。
图2
FH和M129在胶体金测定中的测试结果。

胶体金测定的敏感性和特异性M.肺炎

为了评估胶体金测定的特异性,105拷贝/ ml M.肺炎群岛,金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,链球菌,肺炎氏菌,军团菌,军团菌,嗜血杆菌,假单胞菌铜绿假单胞菌,厌氧菌,衣原体,衣原体,肺炎肺炎,在3个独立实验中评估了呼吸道合胞病毒,腹股沟病毒,流感病毒,人胞嘧啶病毒,人颅脑病毒和肠病病毒。我们的研究结果表明,胶体黄金测定,M.肺炎链球菌和其他病原体之间没有交叉反应的胶体黄金测定鉴定了M.肺炎。

为了评估胶体金测定的敏感性,通过实时PCR定量标准的M.肺炎。提交加入10倍稀释液,得到101至107拷贝/ ml。通过胶体金测定法测试不同浓度的标准M.肺炎。如图所示Fig. 3,浓度为103-107copies / ml的M.肺炎在胶体金测定(3个独立实验)中是阳性的.m。未在101-102份/ ml中检测到肺炎。

图3.
胶体金测定的敏感性。

临床标本数据

从涉嫌M.肺炎的儿童中收集了总共78次喉咙拭子和224个痰标本。如o所示表格1,78(78/302,25.8%)试样在实时PCR中是阳性的。 M.肺炎金额从1×103到8.65×107拷贝/ ml。在胶体金测定中,76(76/302,25.2%)样品为阳性。在胶体金测定中阳性的76个样本也在实时PCR;将相应的患者患有5-10天的疾病过程。在胶体金测定和实时PCR之间存在高统计一致性(Kappa值= 0.98,p = 0.000),表明新开发方法的特异性。与实时PCR相比,胶体金测定的特异性和敏感性分别为100%和97.4%。在胶体金测定中只有两个样品是阴性的,实时PCR中的阳性。最后,确认了两个样品中的肺炎肺炎量,分别具有1.3×103和2.2×103拷贝/ mL。

表格1
胶体金测定与实时PCR之间检测结果的比较。

Discussion

M.肺炎是原发性非典型肺炎和其他呼吸道传染病的常见病原体 14,15。此外,它是5至15岁的儿童中最重要的急性呼吸道感染的药物之一16。我们以前的研究表明,杭州(中国)儿童肺炎肺炎肺炎感染率为18.5%3。需要快速准确地诊断肺炎肺炎肺炎。实时PCR和血清学试验目前用于诊所在中国诊所诊断M.肺炎8,9。但耗时和复杂的协议限制了他们的临床应用。最近,Miyashita等。报告诊断敏感性仅为商业快速抗原套件的实时PCR的诊断敏感性(Asahi Kasei Pharma,Tokyo,Japan)20。在这项研究中,通过靶向特定的P1抗原,我们施加胶体金测定以检测M.肺炎。 P1是M.肺炎的主要表面蛋白之一,其基因是通过实时PCR的临床检测临床检测中的有吸引力的靶标10,17。这是检测P1抗原的第一研究,以确认肺炎儿童肺炎肺炎肺炎感染。临床M.肺炎肺炎菌株可根据其P1基因变体分为两种类型(I和II)18。胶体金测定具有高容量来检测两种类型的肺炎。 M.肺炎可以通过使用我们的方法在15分钟内完成,而实时PCR需要2至4小时,文化通常需要21天 19。此外,该方法在检测M.肺炎(与其他临床病原体的交叉反应)具有高灵敏度和特异性,而血清学检测通常表现出较低的特异性9。值得注意的是,我们发现103份/ ml是这种新方法的检测限,而该值为Asahi Company Rapid Antigen Kit的8.3×104份/ ml20.

在临床实践中,我们使用商业实时PCR测定作为对照方法,靶向P1基因。肺炎。我们将新开发的胶体黄金试验应用于来自肺炎的儿童的302个标本。 76(25.8%)标本对M.肺炎阳性阳性。与实时PCR相比,胶体金测定的特异性和敏感性分别为100%和97.4%。在用氮霉素治疗后,所有M.肺炎阳性儿童的症状都得到了改善。两个样品在实时PCR实时阳性,但在胶体金测定中是阴性的。从两个标本获得实时PCR和临床数据,两者都有103拷贝/ mL。应注意,在访问我们的医院之前,将这些2例患者用抗生素治疗超过一周。我们假设两个样品可能仅含有低量的活体M.肺炎,低于胶体金测定的检测限。

总之,胶体金测定是一种快速,敏感和特异性方法,用于鉴定M.肺炎。最重要的是,这种方法易于操作而无需任何特殊仪器,并且可能适用于床边检测。这些发现表明,新开发的胶体黄金测定将是检测临床实践中肺炎肺炎的有效方法。

Methods

M.肺炎应变和对照菌株

Standard M.肺炎从ATCC购买FH(ATCC 15531)和M129(ATCC 29342)菌株。本研究中使用的阴性对照包括在内金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,肺炎线,肺炎链球菌,肺炎群岛,军团菌肺炎,嗜血杆菌,嗜血杆菌,假单胞菌铜绿假单胞菌,厌氧菌细菌,衣原体肺炎芹菜,衣原体肺炎,腺病毒,呼吸道和呼吸道胞外病毒,Parainfluenza病毒,流感病毒,人巨细胞病毒,人颅糊糊子病毒和肠病病毒。浙江大学医学院儿童医院临床实验室患者分离了所有阴性对照。

来自肺炎儿童的临床标本

2014年2月至8月,本研究报名参加302名儿童。纳入标准是:(1)年龄<14年; (2)参观浙江儿童医院,大学医学院; (3)根据已知准则作为肺炎的初步诊断21。在六个月内,收集了302个标本,包括我们院中的78次咽拭子和224个痰样品。将每个样品与1.5ml盐水混合并储存在-70°C;将1ml混合物用于胶体金测定中的实时PCR和0.5mL。 302名患者(125名女性和177名男性)为3个月至10岁。

该研究按照赫尔辛基宣言进行,并由浙江大学医学院医学伦理委员会批准。所有患者均提供知情同意。

胶体金板的制备

As shown in Fig. 1,胶体金板含有三个部分:1)样品; 2)试剂区域; 3)色谱区域。试剂区域含有单克隆抗体A(小鼠),其标有胶体金,其靶向M.肺炎p1抗原。包括色谱区域M.肺炎单克隆抗体B(小鼠)与测试线位置和小鼠IgG多克隆抗体结合在色谱中的控制线位置。样本M.肺炎将导致单克隆抗体是与之结合M.肺炎由单克隆抗体B以及小鼠IgG多克隆抗体(测试和对照系阳性)检测。在没有M.肺炎,只有单克隆抗体A可以通过IgG多克隆抗体(测试线阴性和对照线阳性)检测。板通过创世纪生物渗透制造&中国杭州生物科技有限公司。

用于M.肺炎的实时PCR检测

对于实时PCR,将1mL将混合物转移到1.5ml微量离心管中无菌上,并在12000rpm / min以12000rpm / min离心5分钟。将细胞粒料重悬于50μl裂解缓冲液(DA AN AN AN AN AN AN AN AN AN); 4μL裂解物作为基于Taqman探针PCR套件(如前所述)的Taqman探针PCR套件(Da An Tene Co.,Ltd.)的实时PCR扩增模板3,22。对于每个测定,对阴性和阳性质量对照和四种正数质粒对照(104,105,106和107份/ mL)进行评估。然后对四种量对照的CT值进行对数线性分析以产生用于确定临床M.肺炎群样品浓度的标准曲线。在95℃下在ABI 7500仪器上进行实时PCR,然后在95℃下进行3分钟,然后进行40个两步循环(在95℃,55℃下为15秒)。

胶体金测定M.肺炎检测

为了进行免疫色谱测定,将100μl(约3滴)混合物加入到样品孔中10-15分钟。具有阳性对照和测试线的样品被确定为M.肺炎积极的;板上没有控制线指示无效的测试,使用第二个测试板,直到结果为正或阴性。

Statistics

使用Kappa测试进行统计分析;使用SPSS 17.0软件(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)计算统计显着性。

附加信息

如何引用这篇文章:李,W.等等。快速诊断支原体肺炎通过免疫色谱抗原测定的肺炎的儿童。SCI。代表。 5,15539; DOI:10.1038 / SREP15539(2015)。

Acknowledgments

本研究得到了国家科学的主要项目支持&技术支柱计划(2012Bai04b05)和浙江省科技计划项目中药(2010ZB084)。

Footnotes

作者捐款W.L.,Y.L.和x.z.设计了该项目。 W.L.,Y.L.和r.t.进行所有实验。 W.L.和S.S.写了主要的手稿文本和准备的数字。所有作者都审查了稿件。

References

  • 科林A. A.,Yousef S.,Forno E.&Korppi M.治疗肺炎肺炎在儿科较低呼吸道感染中。儿科133,1124-1125(2014)。 [PubMed.]
  • Atkinson T. P. &等待K. B.童年中的支原体肺炎感染。 Pediastr。感染。解释。 J. 33,92-94(2014)。 [PubMed.]
  • 徐y.等人。杭州儿童支原体肺炎肺炎的流行病学特征及气象因素。世界J. Pediastr。 7,240-244(2011)。 [PubMed.]
  • Chaudhry R.等人。支原体肺炎引起的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的致命情况。印度人。 J. Pathol。微生物。 53,557-559(2010)。
  • 沃尔斯特A. K.等。印度儿童肺炎肺炎肺炎和哮喘的关联。emems免疫鼠髓。 56,25-31(2009)。 [PubMed.]
  • Ngeh J. &Goodbourn C.Chlamydia Pneumoniae,Mycoplasma肺炎和Legionalla Pneumophila在老年卒中(C-Peps,M-Peps,L-Peps):对老年急性脑血管患者的非典型呼吸道病原体传染性负担的病例对照研究疾病。中风36,259-265(2005)。 [PubMed.]
  • Daxboeck F.,Krause R.&Wenisch C. McoPlasma肺炎感染的实验室诊断。微生物。感染。 9,263-273(2003)。 [PubMed.]
  • Hu C. F.等人。呼吸道疾病和神经症状发作与神经症状发作和血清IgM脊髓脑病中的血清IgM滴度的组合的预后值。 J. microbiol。免疫素。感染。 47,497-502(2013)。 [PubMed.]
  • 常H.y等。实时聚合酶链反应和血清学检测的比较,用于临床诊断非典型肺炎的儿童肺炎肺炎肺炎肺炎。 J. microbiol。免疫素。感染。 47,137-144(2014)。 [PubMed.]
  • Dumke R. &雅各布E.评估五种实时PCR测定检测支原体肺炎。 J. Clin。微生物。 52,4078-4081(2014)。 [PMC免费文章] [PubMed.]
  • Schmitt B. H.,Sloan L. M.&Patel R. Real-Time P. C. R.检测呼吸样本中的支原体肺炎。诊断。微生物。感染。解释。 77,202-205(2013)。 [PubMed.]
  • DI,MARCO。 E.实时P. C. R.检测肺炎肺炎诊断社区肺炎。方法mol。 BIOL。 1160,99-105(2014)。 [PubMed.]
  • AO D.等人。克探针实时聚合酶链反应快速诊断和鉴定儿童细菌性脑膜炎。临床。 Pedias(Phila)。 53,839-844(2014)。 [PubMed.]
  • Waites K. B. &Unkidenton d. f. f. mycoplasma肺炎及其作为人类病原体的作用。临床。微生物。 Rev. 17,697-728(2004)。 [PMC免费文章] [PubMed.]
  • Atkinson T.P.,Palish M. F.&等待K. B.流行病学,临床表现,发病机制和实验室检测支原体肺炎肺炎。有限元微生物。 Rev. 32,956-973(2008)。 [PubMed.]
  • Sidal M.等人。儿童衣原体肺炎肺炎肺炎肺炎肺炎肺炎感染。 J. Trop。 Pediastr。 53,225-231(2007)。 [PubMed.]
  • 周Z.等。中国浙江省成人嵌套PCR检测植物肺炎肺炎肺炎肺炎的比较。 J.感染。开发。 CTRIES。 9,244-253(2015)。 [PubMed.]
  • Kenri T.等。鉴定支原体肺炎的P1 Cytadhesin基因中的新变量序列:证据通过DNA重组在重复序列之间产生抗原变异的证据。感染。 Immun。 67,4557-62(1999)。 [PMC免费文章] [PubMed.]
  • Medjo B.等人。支原体肺炎是儿童社区肺炎的致病因子:临床特征和实验室诊断。 ITAL。 J. Pediastr。 40,104(2014)。 [PMC免费文章] [ PubMed.]
  • Miyashita N.等。快速抗原试验检测肺炎肺炎的诊断敏感性:实时PCR比较。 J.感染。化学其他。 21,473-475(2015)。 [PubMed.]
  • 蛛网症患者呼吸系统群。等等。社区管理指南在儿童中获得肺炎(2013年版)。下巴。 J. Pediastr。 10,745-752(2013)。  [PubMed.]
  • 徐D.,李S.,陈Z.&Du L.在不同呼吸样本中的支原体肺炎的检测。欧元。 J. Pediastr。 170,851-858(2011)。 [PubMed.]


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